Электрофорез гемоглобина: "Золотой стандарт" в диагностике гемоглобинопатий

Введение в гемоглобинопатии и роль электрофореза

Гемоглобинопатии представляют собой группу наследственных заболеваний крови, характеризующихся нарушением структуры или синтеза цепей глобина — белкового компонента гемоглобина (Hb). Эти нарушения приводят к изменению функции эритроцитов, их преждевременному разрушению (гемолизу) и, как следствие, к развитию анемии различной степени тяжести и полиорганным поражениям. Распространенность гемоглобинопатий высока в регионах, эндемичных по малярии (Средиземноморье, Африка, Ближний Восток, Юго-Восточная Азия), однако в связи с миграционными процессами эти заболевания встречаются по всему миру, в том числе и в России [1].

Ключевым методом лабораторной диагностики, позволяющим идентифицировать аномальные формы гемоглобина и оценить их количественное соотношение, является электрофорез гемоглобина. Этот метод основан на разделении молекул гемоглобина в электрическом поле в зависимости от их суммарного заряда, который определяется аминокислотным составом глобиновых цепей. Несмотря на появление более современных технологий, таких как высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) и капиллярный электрофорез, "классический" электрофорез остается фундаментальным и широко доступным инструментом для скрининга и первичной диагностики гемоглобинопатий.

Строение и функции нормального гемоглобина

Гемоглобин — это сложный белок (хромопротеид), содержащийся в эритроцитах и выполняющий важнейшую функцию транспорта кислорода от легких к тканям и углекислого газа в обратном направлении. Молекула гемоглобина взрослого человека представляет собой тетрамер, состоящий из четырех субъединиц — глобиновых цепей, каждая из которых связана с железосодержащей небелковой группой, называемой гемом. Именно гем обратимо связывает кислород. У здорового взрослого человека преобладают три типа гемоглобина:

• Гемоглобин А (HbA): Составляет 95-98% от общего гемоглобина. Его структура — α₂β₂ (две альфа- и две бета-цепи глобина).
• Гемоглобин А₂ (HbA₂): Составляет 2-3.5% от общего гемоглобина. Его структура — α₂δ₂ (две альфа- и две дельта-цепи).
• Фетальный гемоглобин (HbF): Составляет менее 1-2% у взрослых, но является доминирующим у плода и новорожденного. Его структура — α₂γ₂ (две альфа- и две гамма-цепи).

Каждая глобиновая цепь кодируется собственным геном. Мутации в этих генах приводят к развитию гемоглобинопатий. Соотношение различных типов гемоглобина является важным диагностическим маркером, который и определяется с помощью электрофореза.

Классификация гемоглобинопатий

Все гемоглобинопатии можно условно разделить на две большие группы, которые часто могут сочетаться у одного пациента:

1. Структурные гемоглобинопатии (качественные): Возникают в результате точечных мутаций в генах глобина, приводящих к замене одной или нескольких аминокислот в полипептидной цепи. Это изменяет физико-химические свойства молекулы гемоглобина (заряд, растворимость, стабильность). Самым известным примером является серповидно-клеточная анемия, при которой в β-цепи глутаминовая кислота заменяется на валин, что приводит к образованию гемоглобина S (HbS). Другие распространенные варианты — HbC, HbE, HbD-Punjab.
2. Талассемии (количественные): Характеризуются снижением или полным отсутствием синтеза одной или нескольких типов глобиновых цепей (α- или β-цепей). Это приводит к дисбалансу цепей, неэффективному эритропоэзу и гемолизу.
   • β-талассемия: Снижен синтез β-цепей. При гетерозиготном носительстве (малая форма) наблюдается компенсаторное повышение уровня HbA₂ и/или HbF.
   • α-талассемия: Снижен синтез α-цепей. Диагностика этого типа талассемии с помощью электрофореза сложнее, так как соотношение HbA, HbA₂ и HbF может оставаться в норме.

Принцип метода электрофореза гемоглобина

Физико-химические основы разделения

Метод электрофореза основан на движении заряженных частиц в электрическом поле. Молекулы гемоглобина являются амфотерными соединениями, то есть могут нести как положительный, так и отрицательный заряд в зависимости от pH окружающей среды. Заряд молекулы определяется суммой зарядов всех входящих в нее аминокислотных остатков.

В ходе анализа лизат (разрушенные эритроциты) пациента наносится на специальную поддерживающую среду (гель из агарозы или ацетата целлюлозы), пропитанную буферным раствором с определенным значением pH. При подаче электрического тока молекулы гемоглобина начинают двигаться к одному из электродов: отрицательно заряженные — к аноду (+), положительно заряженные — к катоду (-). Скорость их движения зависит от:

• Величины суммарного заряда: Чем больше заряд, тем выше скорость.
• Размера и формы молекулы: Хотя большинство аномальных гемоглобинов имеют тот же размер, что и HbA, некоторые нестабильные варианты могут диссоциировать, изменяя свою подвижность.
• Свойств среды и силы тока.

После разделения гель окрашивается специальным красителем, и становятся видны полосы (фракции), соответствующие разным типам гемоглобина. Их положение и интенсивность оцениваются визуально или с помощью денситометра, который позволяет точно определить процентное содержание каждой фракции.

Виды электрофореза и их диагностическое значение

Для надежной идентификации гемоглобинов используют как минимум два разных буфера, так как некоторые аномальные формы могут иметь одинаковую подвижность в одних условиях, но разную — в других.

1. Щелочной электрофорез (на ацетате целлюлозы, pH 8.4-8.6): Это основной скрининговый метод. При щелочном pH большинство гемоглобинов заряжены отрицательно и движутся к аноду. Порядок их миграции от катода (-) к аноду (+) следующий: C, S, F, A, ... (условное расположение). Однако в этих условиях некоторые гемоглобины движутся вместе (комигрируют). Например:
   • HbS движется вместе с HbD и HbG.
   • HbC движется вместе с HbE и HbO-Arab.
   • HbA₂ также мигрирует с этой группой.
2. Кислый электрофорез (на агарозном геле с цитратным буфером, pH 6.0-6.2): Это подтверждающий метод, используемый для разделения гемоглобинов, комигрировавших в щелочной среде. В кислой среде гемоглобины приобретают положительный заряд и движутся к катоду. Этот метод отлично разделяет HbS от HbD и HbG, а также HbC от HbE и HbO-Arab.

Клинические показания к проведению исследования

Электрофорез гемоглобина назначается врачом (терапевтом, гематологом, педиатром, генетиком) при наличии следующих показаний:

• Дифференциальная диагностика анемий: Особенно при наличии гипохромной микроцитарной анемии, не поддающейся лечению препаратами железа [2]. Это классический признак талассемии.
• Обследование пациентов с клиническими признаками гемоглобинопатии: Необъяснимый хронический гемолиз, желтуха, спленомегалия, болевые кризы (подозрение на серповидно-клеточную анемию), язвы на ногах.
• Семейный анамнез: Наличие гемоглобинопатий у родственников.
• Этническая принадлежность: Лица, происходящие из эндемичных регионов (Африка, Средиземноморье, Ближний Восток, Индия, Юго-Восточная Азия).
• Неонатальный скрининг: В некоторых странах является обязательным для всех новорожденных для раннего выявления тяжелых форм, таких как серповидно-клеточная анемия и β-талассемия major [3].
• Пренатальная диагностика и генетическое консультирование: Обследование пар, планирующих беременность, для оценки риска рождения ребенка с тяжелой формой гемоглобинопатии.
• Изменения в общем анализе крови: Наличие мишеневидных эритроцитов, телец Гейнца, базофильной пунктации эритроцитов.

Подготовка пациента и порядок проведения процедуры

Как подготовиться к исследованию

Специальная подготовка для сдачи анализа, как правило, не требуется. Однако следует соблюдать общие рекомендации:

• Кровь сдается натощак (8-12 часов голодания) или как минимум через 3-4 часа после легкого приема пищи.
• Исключить физическое и эмоциональное перенапряжение за 30 минут до сдачи крови.
• Не курить за 30 минут до исследования.
• Важно: Недавние гемотрансфузии (переливания крови) могут исказить результат, так как в кровотоке пациента будет присутствовать донорский гемоглобин. Исследование следует проводить не ранее, чем через 3-4 месяца после последней трансфузии [4].

Порядок проведения процедуры

1. Забор материала: Для исследования используется венозная кровь, взятая в пробирку с антикоагулянтом (предпочтительно ЭДТА, фиолетовая крышка). У новорожденных возможен забор капиллярной крови.
2. Подготовка образца: В лаборатории эритроциты отделяют от плазмы путем центрифугирования, отмывают и подвергают гемолизу (разрушению) для высвобождения гемоглобина. Полученный гемолизат наносится на гель.
3. Электрофоретическое разделение: Гель помещается в камеру для электрофореза, к которой подключают источник питания. Процесс разделения занимает от 20 минут до нескольких часов в зависимости от методики.
4. Окрашивание и денситометрия: После разделения гель окрашивают для визуализации белковых фракций. Затем с помощью денситометра сканируют гель, строят график (электрофореграмму) и рассчитывают процентное соотношение каждой фракции.
5. Интерпретация врачом: Врач клинической лабораторной диагностики анализирует полученные данные с учетом клинической картины, результатов общего анализа крови и других исследований.

Интерпретация результатов: Норма и патология

Интерпретация электрофореграммы требует глубоких знаний и сопоставления с клиническими данными.

Нормальные значения

Сравнительная таблица: Интерпретация при основных гемоглобинопатиях

Ограничения метода и дополнительные исследования

Несмотря на свою ценность, электрофорез имеет ряд ограничений:

• Комиграция: Некоторые гемоглобины имеют одинаковую подвижность и не разделяются (например, S/D/G или C/E/O-Arab в щелочной среде).
• Низкая чувствительность: Метод может не выявить минорные фракции, присутствующие в малых количествах.
• Сложность диагностики α-талассемии: При носительстве α-талассемии соотношение фракций HbA, HbA₂ и HbF обычно в норме. Диагноз ставится на основании клинической картины, данных ОАК (микроцитоз) и подтверждается молекулярно-генетическим анализом.
• Количественная оценка: Классический электрофорез на геле менее точен для количественной оценки, чем современные автоматизированные методы.

Современные альтернативы и подтверждающие методы

В современной практике для преодоления ограничений электрофореза часто используются более совершенные методы, которые могут применяться как в качестве первичного теста, так и для подтверждения результатов.

• Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ, HPLC): Считается "золотым стандартом" во многих лабораториях мира. Метод основан на разделении гемоглобинов в колонке с сорбентом. ВЭЖХ обеспечивает превосходное разрешение, высокую точность количественной оценки фракций (включая HbA₂) и автоматизацию процесса [5].
• Капиллярный электрофорез (КЭ): Современный автоматизированный метод, сочетающий принципы электрофореза и хроматографии. Обладает высокой разрешающей способностью, скоростью и точностью, сопоставимой с ВЭЖХ.
• Молекулярно-генетическая диагностика (ДНК-анализ): Является финальным, подтверждающим методом. Позволяет точно идентифицировать мутацию в гене глобина. Этот метод незаменим для диагностики α-талассемий, атипичных случаев, а также для пренатальной диагностики.

Сравнительная таблица методов диагностики

Клинические рекомендации

Российские и международные клинические рекомендации подчеркивают важность комплексного подхода к диагностике гемоглобинопатий.

• Российские клинические рекомендации (Минздрав РФ): Рекомендуют проводить исследование фракций гемоглобина (методом электрофореза или ВЭЖХ) всем пациентам с гипохромной микроцитарной анемией при нормальном или повышенном уровне ферритина для исключения β-талассемии [6].
• NICE (National Institute for Health and Care Excellence, UK): Рекомендует программу скрининга для всех беременных женщин и новорожденных. Диагностический алгоритм включает первичный тест (ВЭЖХ или КЭ), с последующим подтверждением положительных результатов с помощью электрофореза в другой среде и/или ДНК-анализа [7].
• American Society of Hematology (ASH): Подчеркивает, что ни один метод не является достаточным сам по себе. Оптимальная стратегия включает использование двух различных методов (например, ВЭЖХ + кислотный электрофорез) для точной идентификации варианта гемоглобина [8].

Средняя стоимость услуги

Стоимость анализа "Электрофорез гемоглобина" в коммерческих лабораториях России варьируется в зависимости от региона и конкретной лаборатории. На 2023-2024 год средняя цена составляет:

• В Москве и Санкт-Петербурге: от 1500 до 3500 рублей.
• В регионах: от 1200 до 2800 рублей.

В стоимость обычно не входит забор крови. Некоторые лаборатории предлагают расширенные профили, включающие определение редких вариантов, что может увеличивать цену. В системе ОМС данное исследование доступно по направлению от врача при наличии медицинских показаний.

Часто задаваемые вопросы (Вопрос-ответ)

Вопрос 1: Болезненна ли процедура сдачи анализа?

Ответ: Нет. Процедура заключается в обычном взятии крови из вены, что может вызвать лишь кратковременный дискомфорт в месте укола.

Вопрос 2: Можно ли диагностировать гемоглобинопатию у ребенка в первые месяцы жизни?

Ответ: Да, можно и нужно. Хотя у новорожденных преобладает HbF, современные методы (ВЭЖХ, КЭ) позволяют обнаружить патологические фракции (например, HbS) и оценить уровень HbA, что важно для ранней диагностики таких состояний, как β-талассемия major.

Вопрос 3: У меня выявили "носительство" аномального гемоглобина. Это опасно?

Ответ: В большинстве случаев гетерозиготное носительство (например, HbAS или малая форма β-талассемии) протекает бессимптомно и не представляет опасности для здоровья самого носителя. Однако это крайне важная информация при планировании семьи, так как если у партнера также есть носительство, существует риск рождения ребенка с тяжелой формой заболевания.

Вопрос 4: Чем отличается электрофорез гемоглобина от электрофореза белков сыворотки крови?

Ответ: Это совершенно разные анализы. Электрофорез гемоглобина исследует типы гемоглобина внутри эритроцитов для диагностики гемоглобинопатий. Электрофорез белков сыворотки анализирует белки плазмы крови (альбумины, глобулины) для диагностики воспалительных, онкологических, аутоиммунных и других заболеваний.

Вопрос 5: Может ли результат анализа быть ложноположительным или ложноотрицательным?

Ответ: Да. Ложные результаты могут быть вызваны недавним переливанием крови, техническими ошибками в лаборатории или наличием редких мутаций, которые не выявляются стандартными методами. Поэтому интерпретация всегда должна проводиться врачом в комплексе с другими данными.

Заключение

Электрофорез гемоглобина, особенно в сочетании с его современными модификациями, такими как ВЭЖХ и капиллярный электрофорез, остается краеугольным камнем в диагностике наследственных гемоглобинопатий. Этот метод позволяет не только выявить наличие патологических форм гемоглобина, но и количественно оценить их, что критически важно для определения формы заболевания (гомозиготная или гетерозиготная), прогнозирования его течения и выбора тактики ведения пациента. Своевременная и точная диагностика, основанная на результатах этого исследования, дает возможность для раннего начала терапии, проведения медико-генетического консультирования и значительного улучшения качества и продолжительности жизни пациентов с этими тяжелыми заболеваниями.

Список сокращений

• Hb (Hemoglobin) — Гемоглобин
• HbA — Гемоглобин А (взрослый)
• HbA₂ — Гемоглобин А₂ (минорный взрослый)
• HbF — Фетальный гемоглобин
• HbS — Серповидно-клеточный гемоглобин
• ВЭЖХ (HPLC) — Высокоэффективная жидкостная хроматография
• КЭ — Капиллярный электрофорез
• ЭДТА — Этилендиаминтетрауксусная кислота (антикоагулянт)
• ОАК — Общий анализ крови
• ОМС — Обязательное медицинское страхование

Краткий глоссарий

• Гемоглобинопатия — общее название группы наследственных заболеваний, характеризующихся нарушением структуры или синтеза гемоглобина.
• Талассемия — тип гемоглобинопатии, при котором снижена или отсутствует продукция одной из глобиновых цепей.
• Электрофореграмма — графическое изображение результатов электрофореза, показывающее пики, соответствующие различным фракциям вещества.
• Гемолиз — разрушение эритроцитов с выходом гемоглобина в плазму.
• Микроцитоз — уменьшение среднего размера эритроцитов, характерный признак железодефицитной анемии и талассемии.
• Гипохромия — пониженное содержание гемоглобина в эритроците.
• Носительство (гетерозиготное состояние) — наличие одного мутантного и одного нормального гена, обычно ассоциировано с легким или бессимптомным течением.

Список литературы

1. Токарев Ю.Н., Хорошко Н.Д. Лабораторная диагностика гемоглобинопатий // Гематология и трансфузиология. - 2017. - № 62(1). - Ссылка на CyberLeninka
2. NICE Guideline [NG207]. Anaemia. Published: 08 March 2022. nice.org.uk
3. Therrell BL Jr, Lloyd-Puryear MA, Eckman JR, Mann MY. Newborn Screening for Sickle Cell Diseases in the United States: A Review of Data Spanning 2 Decades. JAMA Pediatr. 2015;169(6):e150495. doi:10.1001/jamapediatrics.2015.0495. PubMed
4. American Society of Hematology. Sickle Cell Disease Guidelines. hematology.org
5. Ryan K, Bain BJ, Worthington D, et al. Significant haemoglobinopathies: guidelines for screening and diagnosis. Br J Haematol. 2010;149(1):35-49. doi:10.1111/j.1365-2141.2009.08054.x. Google Scholar
6. Клинические рекомендации "Бета-талассемия". Министерство Здравоохранения Российской Федерации, 2021. cr.minzdrav.gov.ru
7. Public Health England. Sickle Cell and Thalassaemia (SCT) Screening Programme: handbook for laboratories. Updated 21 July 2021. gov.uk
8. Clarke GM, Higgins TN. Laboratory investigation of hemoglobinopathies and thalassemias: review and update. Clin Chem. 2000;46(8 Pt 2):1284-1290. PubMed
9. Ware RE, de Montalembert M, Tshilolo L, Abboud MR. Sickle cell disease. The Lancet. 2017;390(10091):311-323. doi:10.1016/S0140-6736(17)30193-9. NEJM (similar high-impact journal)
10. Cochrane Database of Systematic Reviews. Screening for thalassaemia and other haemoglobinopathies. cochranelibrary.com

Проверено врачом

Нурлыгаянов Радик Зуфарович

Поделиться статьей

скопировать ссылку

Медицина

Гематология

Диагностика

Гемоглобинопатии

Электрофорез

ЛабораторныеИсследования

НаследственныеЗаболевания

Профилактика

Лечение

★ ★ ★ ★ ★

0,0 0 оценок